过敏菌商城老赵（微信号：microbio_zhao）先唠叨几句：中外科学家的研究都发现，不健康的饮食会造成菌群失调，从而可能严重影响动物的健康。
了解这些研究，对普通大众管理自己的健康有何借鉴意义呢？
你的先天基因不好，可能会让你的健康比基因好的人差一些，但还不至于让你真正得病。不注意饮食，吃坏了肠道菌群，才有可能是让你最终患病的主要因素。
以后，不要再抱怨父母没有给你好的基因，管理好自己的饮食，养好自己的菌群，才是保持健康的根本。
人们已经知道，“好”的肠道菌群能促进人的健康，而“坏”的肠道菌群却破坏人体健康。那么，具体到一个人，他的肠道菌群到底是“好”细菌为主？还是“坏”细菌占优势？哪些因素在决定着“好”、“坏”细菌的此消彼长呢？
为研究方便起见，可以简单地把影响肠道菌群的因素分成基因和饮食，或者说先天和后天两大类。基因代表从父母那里遗传来的，所以称之为“先天因素”；饮食则是后天干预的主要代表，所以可以作为“后天因素”的代表。在决定肠道菌群的组成上，哪个因素的作用更大？是饮食？还是基因？肠道菌群到底谁做主？对于这个问题不同的回答，将直接决定人的健康管理的理念和操作方法的不同。可见，基因乎？饮食乎？肠道菌群到底谁做主？这个问题，是人体微生物组研究中的一个重要科学问题。
起于聊天的研究
自打1990年开始做菌群研究，这个问题自然一直在老赵的脑子里打转转，却苦于没有合适的研究模型，一直无从下手。没想到，一次看似偶然的聊天，为这项研究打开了一扇门。
中国科学院上海营养所陈雁教授和我一起参与过推动中法肠道元基因组合作，对我们做的肠道菌群工作有着浓厚的兴趣。那是2007年，有一次我们聊天时，他告诉我，他们做了一个很有意思的小鼠试验。原来，他的博士生韩瑞君在研究一种高密度脂蛋白“基因敲除鼠”。这种“敲除鼠”因为有一个基因被人为破坏，天生缺乏高密度脂蛋白这种“好的胆固醇”，吃高脂饲料容易得动脉粥样硬化，他们又新发现了这些基因缺陷的小鼠天生就有一点儿胰岛素抵抗，也就是糖尿病的早期症状，提示这个高密度脂蛋白的基因与糖尿病有关系。
为了观察饮食和基因对健康的影响，他们把这种先天因基因缺陷有点不健康的小鼠与它们的基因没有缺陷的野生型对照，各分成2组，分别吃高脂饲料或者普通饲料，形成了2种基因与2种饲料的组合：“好基因＋好饲料”；“好基因＋坏饲料”；“坏基因＋好饲料”；“坏基因＋坏饲料”。如果基因代表先天因素对健康的影响，饲料可以代表后天因素对健康的影响，这样的设计，为了便于看出基因和饲料谁对肥胖、糖尿病的贡献大。
听到这里，我眼睛一亮，这两种动物只有一个基因不一样，与两种饲料组合，非常适合研究基因和饮食哪个对肠道菌群的影响大。而且，还可以同时观察肠道菌群与肥胖和糖尿病的关系，是个难得的实验材料。真是“踏破铁鞋无觅处，得来全不费功夫”。
这个试验到我们聊天时已经做了快6个月了，就要收摊了，我赶紧让我的博士生张晨虹去找韩瑞君把小鼠的粪便样品采集齐全，而且要求她尽快分析出菌群的结果来。
饮食VS基因：谁主沉浮？
当时我们最拿手的分析菌群结构组成的实验工具只有DGGE指纹图技术。这个技术的原理是把细菌的16SrRNA基因的一个高变区扩增，把不同的序列通过一种电泳技术分离、展示出来，可以得到类似条形码的图像结果。电泳图里面的每一个条带代表一种细菌，条带越粗，表示这种细菌越多，因此，DGGE图谱可以反映菌群的优势菌的组成变化。
张晨虹很快就投入做DGGE指纹图的试验，采集小鼠粪便，做电泳，割胶，克隆，测序，鉴定出每条带所代表细菌的分类地位。忙的时候，两台设备同时上，一天24小时连轴转，做8块胶。这个最高纪录，实验室至今没有人能破。
张晨虹的DNA指纹图结果出来时，小韩那边的动物试验也收尾了。各组小鼠的体重和胰岛素抵抗（代表小鼠的早期糖尿病症状）的数据出来了。结果却出人意料：胖得最厉害、胰岛素抵抗最严重的组合居然是”好基因＋坏饲料”！而原本大家感觉，“坏基因＋坏饲料”那组的小鼠应该是病得最重的组合。再仔细分析进食量，“好基因＋坏饲料”那组小鼠的食量，比“坏基因＋坏饲料”组合要高出大约30％。试验结果表明：只要多吃高脂饲料，动物不需要有基因缺陷也可以得严重的肥胖症和胰岛素抵抗。
那么，这些动物的菌群组成会是一种什么状况呢？基因不同和饲料不同对菌群组成有什么影响呢？能用菌群的组成差别来解释患病程度的差别吗？
对比一下各组动物的DGGE指纹图，结果很有意思：不管是敲除鼠还是野生型，基因一样的小鼠，吃不同的饲料时，菌群结构出现很大的差别，所有的主要的条带都变了，说明不管基因背景如何，吃高脂饲料的小鼠肠道里的优势菌与吃普通饲料的完全不一样。
为了能定量地比较小鼠菌群结构的差别，张晨虹又用一种叫末端限制性片段长度多态性分析（T－RFLP）的方法，对这4组小鼠的菌群做了分析。由于这些数据是用毛细管电泳为核心的桑格测序仪做的，因此，得到的数据比较方便做统计分析。在信息和统计组张梦晖老师的指导下，张晨虹做了主成份分析（PCA）。结果很有意思：所有的动物的肠道菌群结构先按照饲料不同聚成2大类，大约菌群结构变异的56％可以用饲料的不同来解释；在普通饲料上，敲除鼠和野生型可以分开，大约12％的菌群结构变异可以用高密度脂蛋白基因的突变来解释；不过，在高脂饲料上，敲除鼠和野生型的菌群结构几乎混在一起，没有什么差别。这2种指纹图分析的结果告诉我们：饮食结构是决定肠道菌群结构的最重要的因素，其次才是基因。而且，基因造成的菌群结构的差别只在普通饲料上表现的比较明显，在高脂饲料上，几乎看不到基因的影响。
2008年，在中法肠道元基因组合作项目交流会上，我向大会汇报了这个研究结果。大家都非常兴奋，因为这是当时第一个用动物模型，研究饮食和基因对菌群的影响的最有说服力的研究结果。
基因测序，解析菌群
不过，DNA指纹图技术只能告诉我们肠道菌群整体结构的差别。对DGGE图中的重要的条带里的DNA进行割胶、测序，累死累活也只能鉴定出有限的那么几十种。面对“浩如烟海”的肠道菌群，新技术是当务之急。记得上海生物芯片中心的张庆华老师就常给我讲：立平，要想想办法，再不能用DGGE这样的“小米加步枪式”的方法研究菌群啦，否则什么都难以搞清楚！454焦磷酸测序技术的出现，为解决这个问题带来了曙光。
454测序技术是新一代测序技术的代表之一。这个技术一次可以测定几十万条序列，每个碱基的测定成本大幅度降低，一台机器的测序能力抵得上100台老一代的桑格测序仪。不过，要把这个方法用到菌群样品的测序，需要解决如何一次测定几百个样品还能把每条序列是从哪个样本来的分辨清楚的问题。
2006年8月，我到维也纳参加国际微生物生态学大会，在大会上被选为学会的常务理事。会议结束后，去瑞典访问了詹森教授，她是微生物生态学领域很活跃地做菌群的专家。在那里我了解到，当时已经有人把每个样品在做PCR扩增时，引物前面加一段特殊的标记序列叫barcode，有点像商品上的条形识别码。这样，就可以把几百个样品混在一起做一次454测序，然后把几十万条序列按照识别码的不同进行分配，最后，就可以一次拿到几百个样品的序列，每个样品可以测定上千条，足以用序列的多样性组成来反映样品里的微生物的种类组成。据他们讲，这个思路是他们最先提出来的，但还没有来得及发表，就被别人抢先了，很是郁闷（所以，当面对先发表，还是再补充实验追求高影响因子之间，就不要再纠结了，毕竟科学界只承认第一。先发表为王！）。
我从瑞典回来以后，就让张晨虹和我们实验室负责建立新的分析技术的张晓君老师开始关注新一代测序技术在微生物群落结构分析中的应用。这个时候，好消息来了，赵国屏老师做执行主任的国家人类基因组南方中心新进来一台454测序仪，而且很快就投入运行，做基因组测序效果不错。我当时决定，用这个动物试验的样品把454测序技术进行菌群结构分析的方法在我们实验室建立起来，彻底告别“小米加步枪”的时代。
454测序技术一次可以测定几十万条DNA片段的序列，如果要用这个方法测定多个样品的菌群结构就需要把每个样品的DNA片段在序列上做唯一性标记，这就是所谓的DNA barcoding （DNA条形码技术）。最早发表这个技术思路的，是斯坦福大学医学院富尔实验室，他们与微生物系的同事合作，建立了在每一条需要测序的DNA片段两端加上独特的4个碱基的序列，作为样品的标记，然后把所有样品的DNA片段等量混合，在454测序仪里做一次测序的方法。测序结束后，可以利用DNA条码序列把每个DNA片段准确地分配到其所属的样品里，这样，每个样品就有几百乃至上千条序列了。这样做下来，虽然一次测序的成本比较高，但摊到每个样品费用在几百元，还是很合算的。
做这个工作，离不了生物信息人才。曹又方是1998我在山西大学时从应用数学专业推荐到生物化学和分子生物学专业读硕士的，后来跟我到了交大。他应该是中国最早做生物信息的学生之一了。此外，还有一名交大计算机专业的学生华蔚颖跟着我读生物信息方面的硕士。小华是交大计算机系俞勇老师给我推荐的。（生物科学研究才是大数据分析的英雄用武之地！相信在接下来的科学研究中，生物和大数据的结合会出现一批伟大的科学研究成果，并极大地影响和改变我们的生活。）
小曹带着华蔚颖，设计了DNA条码序列，以及从原始测序的序列开始，进行序列到样品的分配、质量控制和比对、做树、分类地位认定等等整个流程需要的软件和数据库。我们的原则是：除了用454测序仪读取序列这一步，所有流程要全部在自己实验室能做起来。
几个试验的样品凑在一起，第一个run测了差不多300个样品。为了检验这个方法的可靠性和重复性，包括了一些已知序列的样品，其中小鼠试验的样品又有一部分做了3次重复。张晨虹和华蔚颖经过艰苦的努力，终于拿到了菌群组成的数据。也就是说，按照序列差异不超过3％归并成一个“种”（OTU）的话，一共得到516种细菌在所有小鼠中的丰度分布的数据。
有了这个数据矩阵，张梦晖指导张晨虹，尝试着用各种多变量统计方法观察各组之间的差别。首先，用Rob Knight等人发明的UniFrac方法观察了数据的自然结构。结果显示，饮食的确是影响菌群结构的最重要的因素。然后，用PLS-DA进行分类建模，试着用菌群组成的数据预报一只小鼠吃什么饲料？有没有基因突变？是不是健康（有没有胰岛素抵抗）？经过留一交叉法检验，模型是可靠的，预报的准确率也比较高，然后又用一些统计方法把对分类贡献大的菌群种类挑选出来。我们用挑选出来的关键细菌种类的数据做同样的模型，结果与用516个变量的一样好，说明对分类真正有贡献的变量被挑出来了。这样，我们一共找到61种细菌，它们在饲料、基因或者健康状况发生变化时，会相应地改变自己在肠道里的丰度，而其他的细菌的变化则与我们感兴趣的这几个变量没有什么关联。这是一个数据降维、降噪的过程。也是从一片混沌的数据里找到有意义的规律的过程。
当我们把这61个关键细菌在每只小鼠中的丰度做成热图后，可以看出一些很有意思的现象。首先，在整个菌群中占的比例最大的是一个叫做丹毒菌科的“科”。属于这个科的关键变量又分成M1－4共4个组。M1组在健康肠道里很多，可以占到总菌量的20％左右，不过，只要动物有了胰岛素抵抗（不管是基因突变引起的，还是高脂饲料引起的，也不一定要伴随有肥胖），这类菌的数量就降到1％以下；M3在吃普通饲料的小鼠肠道里可以占到总菌量的40％以上，在吃高脂饲料的肠道里会降到1％以下；M2和M4则只在吃高脂饲料的肠道里特别多。M2、3、4的丰度变化只与饲料类型有关，与基因是否突变和动物是否得病都没有关系。
在这61个关键细菌里，还发现：双歧杆菌在饲喂高脂饲料6个月后，无论动物是什么基因型，都检测不到了。更有意思的是：脱硫弧菌科里有一个菌，在病得最重的“好基因＋坏饲料”的组合里，丰度最高，是最健康的“好基因＋好饲料”组合的7倍还要多。
大量研究报道，双歧杆菌对肠道屏障有保护作用。这类菌如果被排空了，动物肠道的通透性可能就会升高，也就是说，肠子开始有点漏了，肠道里的乱七八糟的毒素就容易进入血液。而脱硫弧菌科里的细菌是所谓的“硫酸盐还原菌”，它们可以把硫酸盐还原成有致癌活性和腐蚀性的硫化氢。另外，这些菌是条件致病菌，它们的细胞壁上的脂多糖具有很强的内毒素活性，进入血液可以诱发炎症。因此，双歧杆菌的减少乃至被排空、条件致病菌的丰度上升，可能会造成肠屏障功能下降、内毒素进入血液而诱发慢性炎症、推动代谢损伤的发展。因此，高脂饲料可能通过清除有益菌和增加有害菌来影响人体的健康。
我们的这项研究首次表明：饮食对肠道菌群的影响大于基因的作用。多吃不健康的饲料，“好基因”动物也比“坏基因”动物更胖，更容易得糖尿病。而且，我们通过多元统计分析，找到了可能与肥胖发生密切相关的具体的肠道细菌种类，为进一步深入研究肠道细菌影响人体健康的指明了方向，奠定了基础。正是因为有了这个工作，才有了后来我们对能引起肥胖的人体肠道细菌的“验明正身”（发现肥胖细菌的故事，先按下不表，且听以后分解）。
这项研究的结果，于2009年10月29日在ISME Journal在线发表，随即引起广泛关注。
“饮食主沉浮”得到再次证明
当然，老赵实验室的这项研究只做了一种基因和两种饲料配合对菌群和健康的影响。“饮食对肠道菌群的影响比基因更重要”的结论是不是有普遍意义，需要更多的基因类型与不同饮食进行组合的研究。
2015年1月， 国际期刊Cell Host ＆ Microbe 刊登了美国加州大学旧金山分校和哈佛大学Peter J. Turnbaugh研究小组的一项最新研究成果。他们研究了五种不同的近交系小鼠和超过200只远交群小鼠，结果发现：“相比于宿主基因型，饮食对个体肠道菌群环境改变起到更为重要作用。” 因此证明“饮食对菌群的影响超过基因”是个有普遍意义的结论。
Peter J. Turnbaugh是著名肠道菌群研究专家Jeff Gordon的学生。博士毕业后，留在哈佛大学从事系统生物学方面的研究。2011年5月，我应哈佛大学分子生物学系RichLosick教授的邀请前去讲学。报告的头一天晚上，Rich请我和他几位同事一起吃饭聊天。那天的晚餐上，认识了Peter。每个人都聊了自己的研究。和同行们在一起，科学家聊起自己的工作，总是很兴奋。2014年5月，我在他参与组织的Keystone研讨会上做报告，有缘再次相聚、神聊。记得当时他高兴地告诉我，他被加州大学旧金山分校聘为教授，要来一次跨越美洲大陆的大搬家了。
今天，看到Peter他们发表的论文，进一步证实了我们的研究结论，感到很欣慰。
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