益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang―从基础研究到产业化开发

“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室，国家奶牛产业技术体系乳制品加工研究室, 内蒙古农业大学,呼和浩特，内蒙古，010018

前言. 

近10年来，我国乳品工业进入了高速发展阶段，特别是益生菌发酵乳制品的产销售量逐年增加，年平均增长率达到20%以上。遗憾的是，目前乳品企业几乎全部采用进口益生乳酸菌菌种和发酵剂，不仅生产成本高，更重要的是长此以往必将制约乳酸菌和发酵乳制品产业的发展。解决这一问题的根本在于研究和开发具有自主知识产权的益生乳酸菌菌种和发酵剂的相关技术和产品。
        在益生菌研究领域，日本及欧美发达国家通过广泛深入地研究和多年的积累，都已开发出国际知名菌株及其产品，并进行了相应的专利保护。随着”人类基因组计划”的顺利完成，该研究领域也逐渐深入到”组学”水平。我国在益生菌研究方面起步相对较晚，基础研究不系统、不深入、无连续性、研究分散、也不集中。高校及其它研究机构都还没有建立真正意义上的乳酸菌菌种资源库，同时对益生菌的基础研究也不系统，在基因组学和蛋白组学研究领域更是滞后于国际。基础研究的不足使得产业化严重滞后。
        益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang是我国自主研发的、具有自主知识产权益生乳酸菌，经过10多年的基础研究积累,成功的进入了工业化生产。本文就益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang从基础研究到产业化开发做一综述。
        1．乳酸菌资源的收集和菌种资源库的建立［1-26］
        2001年-2009年，分别从中国内蒙古、新疆、西藏、青海、云南、四川、甘肃等少数民族居住地区以及蒙古国14个省市采集自然发酵酸马奶、酸驼奶、酸牦牛奶、酸牛奶、酸山羊奶、乳扇、乳饼、酸乳清、鲜牛奶、曲拉、发酵奶油等传统发酵乳制品等计951份。依据乳酸菌鉴定技术规程，采用生理生化并结合分子生物学手段，从上述采集的样品中分离、鉴定、保藏了7个属，58个种和亚种的共3, 388株乳酸菌，建成了中国最大的具有自主知识产权的乳酸菌菌种资源库。同时完成了3, 388株乳酸菌16S rRNA基因序列的测定和分析工作，数据已上传到NCBI上(http://www.nibi.nlm.nih.gov ，菌株编号：IMAU10001-IMAU80872)。 

               
        2．益生菌L. casei Zhang的筛选及功能评价［27-43,70-71］
        2．1 益生菌L. casei Zhang的筛选：综合耐酸性、耐胆盐性能、牛磺胆酸钠水解能力、模拟胃肠消化体系的转运等指标，从菌种资源库分离自传统酸马奶的243株乳杆菌中筛选获得1株优良潜质的益生菌L. casei Zhang。L. casei Zhang在pH为3.0和2.5的人工胃液中消化3小时及在pH 8.0的人工模拟肠液中消化8小时后的存活率分别为为98.4%，69.4%，97.6%和95.37%，可耐受胆盐的最大浓度为1.6g/100mL；其对Caco-2细胞的黏附率为4.31%；对牛磺胆酸钠解共轭所产生的游离胆酸量2.28mM/L。
        2．2 益生菌L. casei Zhang对高脂血症模型大鼠脂质代谢的影响：将L. casei Zhang菌体灌胃高脂血症模型大鼠（2 × 108 cfu/d），30天后大鼠血液中的甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量分别下降了31.3%和30.8%；肝脏组织中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量下降了20.4%和17.5%。说明L. casei Zhang具有降血脂作用。
        为了深入研究L. casei Zhang降血脂作用的分子机制，利用DNA芯片技术对大鼠肝脏组织的基因表达进行了检测。研究表明：灌服L. casei Zhang大鼠肝脏组织中与脂肪酸-氧化相关的5个基因（包括长链脂肪酸连接酶、羟酰辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰基转移酶、酰基辅酶A脱氢酶和戊二酰-辅酶A脱氢酶）的表达量显著升高（p<0.05），这表明L. casei Zhang可以加速脂肪酸的氧化进而促进TG的分解代谢从而达到降血脂的作用。
        2．3 益生菌L. casei Zhang的免疫调节作用：用L. casei Zhang菌体灌胃小鼠（2.5×108 cfu/d和1×109 cfu/d），结果表明：L. casei Zhang可明显上调血液中IFN-γ和IL-12（P<0.05），下调IL-1α和TNF-α水平（P<0.01），同时可显著提高小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+的比例（P<0.01），并可显著增加小鼠血清IgG的含量和小鼠肠黏膜SIgA的含量（P<0.01）；小鼠肠道粘膜相关淋巴组织中Peyer’s结计数、计分值显著提高（P<0.01），并可显著提高肠粘膜内CD3+、IgA+细胞数量及表达强度(P<0.01)。这说明该菌株对小鼠的细胞免疫、体液免疫及肠黏膜局部免疫具有调节功能。
        2．4 益生菌L. casei Zhang对病原性大肠杆菌的拮抗作用：用L. casei Zhang菌体饲喂小鼠(4 × 107cfu/d)，然后分别用 E. coli O157 和 K88 进行攻毒,攻毒4天后取对照组和实验组未死亡小鼠的肠内容物，用选择性培养基分离纯化大肠杆菌和乳酸菌，并进行基因组ERIC-PCR扩增分析。研究表明，灌服L. casei Zhang可以使攻毒后小鼠的死亡率由66.67%降低至5.56%，在停止饲喂L. casei Zhang的第4天从小鼠肠道内仍然能分离到 L. casei Zhang，但未分离到 E. coli O157和 K88，同时饲喂L. casei Zhang可使小鼠肠道中大肠杆菌总数明显低于对照组（p<0.01）,这一研究结果表明L. casei Zhang可以在小鼠肠道内定殖并能起到拮抗病原菌的作用。
        2．5 益生菌L. casei Zhang 对大鼠抗氧化能力的影响：用L. casei Zhang菌体灌服大鼠28天（4.0×109 cfu/d），与对照组相比,L. casei Zhang可使大鼠肝脏组织匀浆中的过氧化物酶（SOD）和谷胱苷肽过氧化物酶（GSH-Px）活力极显著提高(P<0.01)，大鼠肝脏组织中的氧化产物-丙二醛 (MDA)浓度极显著降低(P<0.01)。说明L. casei Zhang可提高大鼠体内抗氧化作用。
        2．6 益生菌L. casei Zhang对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用：以H22荷肝癌瘤小鼠为模型，用L. casei Zhang灌服小鼠12天（5×108 cfu/d和1×109 cfu/d）。结果显示：L. casei Zhang实验组的巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数、小鼠血清中TNF-β含量与对照组比较均有显著提高（P<0.01，P<0.05）；L. casei Zhang菌体对H22移植性肿瘤的生长具有显著的抑制作用，抑瘤率分别达到40.22% （P<0.01）和41.90％(P<0.01)；实验组H22肿瘤细胞Bcl-2蛋白表达明显降低，而Bax蛋白表达增强，与荷瘤对照组相比有显著性差异(P<0.01)。L. casei Zhang其抗肿瘤机制可能是通过增强荷瘤小鼠免疫功能及同时促进肿瘤细胞Bax蛋白表达，抑制Bcl-2表达，诱导肿瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤的作用。
         2．7益生菌L. casei Zhang在人体肠道中的存活及对肠道菌群的影响：应用荧光定量PCR（RT-PCR）技术定量研究不同时期24个志愿者粪便中L. casei Zhang的数量,结果显示：服用L. casei Zhang 28天时，L. casei Zhang在志愿者粪便中平均为108.55cfu/g。停止口服L. casei Zhang 14天时为105.52cfu/g,这说明L. casei Zhang不仅可以在人肠道中存活,而且可以在人肠道中定植并繁殖；应用种属特异性引物对服用L. casei Zhang的志愿者肠道内的优势菌群进行定量分析，结果表明口服该菌株可以有效增加肠道中双歧杆菌（p<0.01）和奇异菌群数量（p<0.0001），梭菌属的数量显著减少（p<0.0001），而拟杆菌数量变化并不显著; 焦磷酸测序（79%reads长度为270bp；平均每个样品测序20149条）结果表明L. casei Zhang对受试者肠道微生物丰度产生了显著的影响，其中服用L. casei Zhang后宿主肠道中拟杆菌门数量显著上升（p<0.01），而酸杆菌门、绿弯菌门、脱铁杆菌门、梭杆菌门、变形菌门等数量显著下降（p<0.01），放线菌门呈先上升后下降的趋势。
        3．益生菌L. casei Zhang基因组学和蛋白质组学［44-53,72-73］
        3．1益生菌L. casei Zhang基因组学研究：采用全基因组鸟枪法测定益生菌L. casei Zhang全基因组序列并进行了功能基因组学分析（图 2）。结果表明：该菌株的基因组由1条染色体(GenBank登录号：NC_014334)和1个质粒plca36(GenBank登录号：NC_011352)组成。L. casei Zhang 基因组富含双组分调节系统、糖代谢相关基因，包括大量的磷酸转移酶系统和一个在乳酸菌中独有的肌醇代谢基因簇，且编码一个典型relBE毒素-抗素系毒统，可能对该菌株适应复杂生存环境有重要作用。此外，L. casei Zhang还编码2个特有胞外多糖合成基因簇和6个粘液结合相关蛋白，具备合成胞外多糖和粘附定植的遗传学特点。
        3．2 益生菌L. casei Zhang蛋白质组学研究：利用蛋白质组研究技术在国际上首次建立了干酪乳杆菌不同生长时期蛋白质表达图谱，获得酸和胆盐胁迫下差异表达蛋白质图谱（图 2）。结果显示：48种蛋白质在L. casei Zhang不同生长阶段的表达变化明显，主要包括代谢及应激相关蛋白，可能有助于L. casei Zhang在稳定期适应环境变化，增强其抗逆能力；在胆盐胁迫下有26种蛋白表达发生显著变化，主要包括分子伴侣、糖代谢、转录调控、氨基酸代谢和氨基糖代谢相关蛋白；在酸胁迫下有15种蛋白表达发生显著变化，主要包括分子伴侣、脂类代谢和转录调控相关蛋白。两种不同胁迫环境诱导部分类同蛋白表达发生变化，说明该菌株应对胆盐和酸胁迫环境可能有共同的调控机制。
 
                                                      图 7 L. casei Zhang菌体形态电镜图、基因组和蛋白质图谱
        4．益生菌L. casei Zhang直投式发酵剂的研发和产业化［54-59］
        采用RT-PCR技术系统的研究了L. casei Zhang在不同发酵条件和发酵不同阶段16个关键酶基因表达模式的变化，包括葡萄糖激酶、β-葡萄糖苷PTS E II、磷酸-丝氨酸结合蛋白磷酸化酶等，建立了L. casei Zhang在高密度发酵过程中的代谢分子机制。根据L. casei Zhang的代谢分子机制和营养需求，对其增菌培养基成分和含量进行筛选和优化，确定了L. casei Zhang的高密度发酵工艺，可获得活菌数为4×1010cfu/mL以上的发酵液，经冷冻干燥可得到2×1011cfu/g以上活菌数的高活力的发酵剂，可以满足于益生菌制剂或益生菌发酵乳制品等生产。
        在抗冷冻方面的研究中，研究发现冷冻干燥过程中糖类的添加对L. casei Zhang细胞膜的zeta电位、疏水性、流动性和完整性均有不同程度的影响，在此基础上开发出了适合L. casei Zhang冷冻干燥过程中有效的抗冻保护剂。
        2010年6月, 合作企业—内蒙古普泽生物制品有限责任公司投资6, 000万人民币，成功的将 L. casei Zhang发酵剂进行了工业化生产，产品中活菌数达到2×1011cfu/g以上，达到国际同类产品的水平。
        直投式发酵剂的研发和产业化过程中主要关键技术是创造性地将分子生物学技术和理论用于建立益生菌高密度培养的方法和理论开发出了适合用于L. casei Zhang的高密度发酵和抗冷冻干燥技术和工艺。
        5．益生菌L. casei Zhang发酵乳制品和发酵豆乳制品的研究开发及产业化［60-69,74-75］
        5．1 益生菌L. casei Zhang在牛乳和豆乳中的发酵及贮藏特性的研究：研究结果显示，接种量相同时，L. casei Zhang在豆乳中的生长速度快于牛乳；发酵结束后，豆乳中活菌数可达109 cfu/mL，远高于牛乳中的活菌数（108 cfu/mL）；4℃贮藏28天期间，L. casei Zhang在豆乳和牛乳中均可维持较高的活菌数（＞108 cfu/mL）。说明L. casei Zhang适合用于发酵牛乳和豆乳制品的生产。
        为了探明L. casei Zhang生长的分子机理，利用L. casei Zhang全基因组基因芯片对其在牛乳和豆乳发酵过程中的表达谱进行了比较分析。结果显示：在牛乳中，差显基因大都参于碳水化合物代谢、能量代谢、无机离子代谢；在豆乳中，除碳水化合物代谢、脂类代谢和无机离子代谢相关基因外，48.6%的上调控基因（＞3倍）与氨基酸转运和代谢关联。这说明L. casei Zhang在牛乳、豆乳中有着类似的生长分子机制，但因为不同发酵乳体系在蛋白质、氨基酸和矿物质组成方面不同而使其生长速率有所差异。
        5．2 益生菌L. casei Zhang发酵乳和发酵豆乳益生菌饮料的产业化：根据上述分子机理，建立并优化了L. casei Zhang发酵乳和发酵豆乳益生菌饮料的生产工艺。2010年，采用独特的2段发酵工艺，L. casei Zhang益生菌发酵豆乳饮料—百益多(与我们实验室开发的另一益生菌Bifidobacterium lactis V9共同发酵)在青岛君益食品公司投产，产品中L. casei Zhang活菌达到500亿/100mL以上，是目前我国市场上益生菌饮料中最高活菌数的5倍，且在货架期内活菌数一直保持不变。
        2011年2月，L. casei Zhang成功地应用于内蒙古伊利集团QQ星儿童益生菌乳饮料的生产，一举打破了多年国外益生菌在我国乳品企业的垄断局面。
        6．结束语：本项目的研究开发不仅打破了多年国外产品和技术的垄断，而且大大促进和提高了我国益生乳酸菌及其相关技术和产品的自主科技创新能力。该项目的实施和完成，将有助于我国乳酸菌和发酵乳制品产业的可持续发展，同时也可满足人们日益增长的健康需求。该项目的实施也可为培养我国微生物学、乳品科学、基因组学等领域的高级人才奠定了良好的基础。
        致谢：本研究是在国家高技术研究发展计划（2006AA10Z345，2007AA10Z353，2010AA10Z302）；国家自然科学基金项目（30560097，30760156，30860219，31111120079）；国家杰出青年科学基金项目(No. 31025019)；973计划前期研究专项(2010CB134502)；“十一五”国家科技支撑计划重点项目（2009BADC1B01）；国家现代农业产业技术体系建设项目（No.nycytx-0501）；教育部科学技术研究重点项目（205028）；教育部春晖计划项目（Z2004-2-15009）；教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-06-0269）；教育部创新团队发展计划(2010-2012)支持下完成的，在此表示感谢。同时感谢内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室所有参加该项目研究的人员。
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