Nature|大肠中降解胰蛋白酶的共生菌鉴定-过敏菌商城

大家好，我今天给大家分享的文献是今年发表在Nature上的文章，题目是：大肠中降解胰蛋白酶的共生菌鉴定

本文有3个通讯作者，分别是来自日本理化学研究所的Kenya Honda、Koji Atarashi和美国哈佛医学院麻省总医院的Ramnik Xavier，他们三人的主要研究领域都是微生物与免疫。

在消化道内存在着丰富的消化酶，其中胰腺分泌的胰蛋白酶是消化道内蛋白酶的主要成分。胰腺分泌的胰蛋白酶原在肠激酶的作用下剪切激活，形成胰蛋白酶。消化性胰蛋白酶在人体消化道运输过程中发生蛋白质水解分解，这被认为是通过胰蛋白酶介导的裂解发生的，称为自溶。自溶也被认为通过消除过早激活的胰内胰蛋白酶对胰腺炎发挥保护作用，人阳离子胰蛋白酶的自溶在体外非常缓慢，这与文献记载的肠道胰蛋白酶降解或推定的保护作用不一致。所以存在其他的降解途径。

2007年PNAS报道了凝乳蛋白酶C可以触发阳离子胰蛋白酶的降解，选择性地分裂Ca2+结合环内的Leu81-Glu82肽键，阳离子胰蛋白酶进一步降解和失活，是通过胰蛋白酶切割Arg122-Val123肽键实现。而高浓度Ca2+抑制胰蛋白酶的降解，在十二指肠的高Ca2+环境中，糜凝胰蛋白酶C促进胰蛋白酶原的激活，而在小肠中，糜凝胰蛋白酶C促进胰蛋白酶降解。胰蛋白酶还可以激活胰蛋白酶原，这一过程称为自激活，有助于十二指肠中的酶原激活。

2017年，郭春君老师在cell发表文章，阐明肠道菌群代谢物抑制酶宿主活性。通过将细菌编码非核糖体短肽合成酶基因过表达，其产生的二肽醛能够抑制蛋白酶活性，选择性靶向人的一些组织蛋白酶。但是肠道菌群对宿主蛋白酶活性的调控尚未被明确阐明。

为了研究肠道菌群对肠蛋白的影响，作者收集了GF小鼠和SPF小鼠的盲肠内容物，进行蛋白质组学测定。检测到713种宿主来源的蛋白质，其中有324种在SPF小鼠水平更高。45种是在GF小鼠中水平更高。其中小鼠亚型的胰蛋白酶PRSS2在GF小鼠中升高。

接着作者从胰蛋白酶活性，WB以及免疫荧光上进行评估，GF小鼠中胰蛋白酶水平高于SPF小鼠。接着作者发现胰腺中产生的胰蛋白原的mRNA水平在两组小鼠中没有差异，其活性差异是从盲肠开始的。这些数据表明胰蛋白酶可能是由大肠内的微生物群成员调节的。健康的人和小鼠的粪便中胰蛋白酶的活性较低，而炎性肠病患者和IL10缺乏的结肠炎小鼠的粪便样本有较高的胰蛋白酶活性，这提示肠道菌群调节胰蛋白酶降解，可能具有重要作用。

之前虽然已经阐明肠道菌群对胰蛋白酶活性具有重要作用，但是其效应菌株并未阐明。作者招募了6名日本健康志愿者（A-F），对GF小鼠进行菌群移植，其中A、C、D、E、F五名志愿者的粪便移植具有降低粪便胰蛋白酶活性的作用。接着选择了C组中的一只老鼠C5，将它的粪便移植给新的一批GF小鼠，为了缩小范围，将小鼠分为4组，分别给予氨苄西林、甲硝唑和泰乐菌素处理。结果GF小鼠接受C5菌群后，胰蛋白酶活性降低，给以AmpB后进一步降低，而MNZ和Tyl处理后，活性升高，表明C5中发挥降解胰蛋白酶活性的菌，在Amp处理中升高，而在MNZ和Tyl处理中减少。因此作者选取了Amp组的其中一只老鼠，将其粪便在厌氧条件下培养，选取了432个不同的菌落，进行16srRNA测序，发现了35个菌株。

作者将肠道菌群含量与胰蛋白酶活性相关性进行了排序，并将35个菌进行了分组，并进行了mix，进行后续实验。其中35-mix，明显降低胰蛋白酶活性，进一步缩小范围后是14-mix发挥作用。

进一步缩小范围是3-mix发挥了降低胰蛋白酶活性的作用。接着将菌株与重组小鼠胰蛋白酶进行体外孵育，表明P. clara 1C4是唯一具有降低胰蛋白酶能力的菌株，定植3-mix中的其他两种菌不能降低胰蛋白酶活性。WB结果与以上结果相符合。此外，P. clara菌对人的胰蛋白酶亚型也具有降解活性。

作者选取了集中P. clara和P. xylaniphila以及进化关系较近的Prevotella属的菌，结果表明，Paraprevotella属的菌具有降解胰蛋白酶活性的特点。

将GF小鼠粪便与菌孵育，胰蛋白酶衍生肽增加，胰蛋白酶蛋白水平减少，活性降低，而不影响其他蛋白。另外，菌发挥作用只在Ca2+存在的情况下，而菌上清没有此作用。活菌及其上清本身均没有蛋白酶活性。

用胰蛋白酶抑制剂AEBSF、Leupeptin、TLCK预处理胰蛋白酶，会抑制P.c的降解效果，提示其降解是由胰蛋白酶依赖性的自溶介导的。此外，荧光标记的胰蛋白酶在Pc菌周围聚集，因此胰蛋白酶降解可能发生在菌表面，与表面分子结合，促进胰蛋白酶的积累和自溶。接着作者使用二琥珀酰亚砜(DSSO)，一种化学交联剂，来检测P. c上与his标记胰蛋白酶相互作用的分子。DSSO处理导致出现了一个新的高分子质量的条带(约250 kDa)，被抗his -tag抗体印迹，表明含有胰蛋白酶复合体，条带的模糊外观表明胰蛋白酶与大小不均的分子相互作用。

拟杆菌门以复杂的聚糖装饰它们的细胞表面，因此，作者使用抑制剂来靶向糖聚糖的合成，推断糖聚糖结合分子可能是胰蛋白酶结合的伙伴。使用tunicamycin抑制脂多糖聚糖的生成，抑制了胰蛋白酶的降解，并且招募胰蛋白的能力也出现了降低。使用另一种抑制剂2F-Fuc，抑制含海藻糖的多糖生成，也出现了相同的作用。Tunicamycin处理导致含糖蛋白的丢失，导致蛋白质脱落到上清中

通过该系统分泌的蛋白，其C端含有保守结构区（CTD），T9SS协助蛋白穿过外膜至细菌表面，并且去除CTD，并介导蛋白与表面多糖的粘附。

P.c菌中含有T9SS基因（也就是por基因），因此作者推测T9SS分泌的表面蛋白可能负责胰蛋白酶的招募和降解。为了验证这一点，作者构建了porU突变的菌株，突变之后P.c菌就丧失了降解胰蛋白酶的作用。接着作者对P.c菌细胞上清进行了蛋白质组学测定，发现tunicamycin处理后，有20个蛋白在上清中上调。作者构建了一系列基因突变菌株。

作者发现00502和00509的突变会影响P.c菌降解胰蛋白酶的作用，这与PorU及WecA（tunicamycin的靶标）的作用类似。这两种突变都表现出招募胰蛋白酶能力的降低，但未出现生长抑制，表明胰蛋白酶降解对细菌生长不是必要的。同源比对发现，00502-00509这几个基因在这个属内是保守的。其中00503-00508对降解胰蛋白酶没有影响。

接着，作者构建了重组蛋白，本身没有蛋白酶活性，但其游离形式不能降解胰蛋白酶，但将其偶联到microbeads上后，可以招募胰蛋白酶。其中00502可招募并降解，但是00509可以招募，不会降解。

重组蛋白00502有两条带，一条对应单体形式，另一条可能是寡聚物。在与胰蛋白酶孵育后，条带会变大，表明胰蛋白酶与00502的任何一种形式形成复合物，而且回收之后分析每个条带也都检测到了00502和胰蛋白酶。而00509没有低聚合物。这些数据表明00502具有低聚的趋势，低聚的00502可能将多个胰蛋白酶分子聚集在一起，以促进自溶

使用软件预测结构，应该是N端是WD40亚基，含有五个Ig类似的结构域组成。其中四个是形成clustering zone，而C端的Ig-like亚基是T9SS结合的亚基。其结构域牙龈卟啉单胞菌的RgpB蛋白相似，其中KXXXKmotif是T9SSc端含靶结构域蛋白的一个特征。

接着，作者为了证明00502和00509在体内对胰蛋白酶的降解作用，作者将WT，敲除00502和00509的P.c菌以及其他两种菌一起定植（P.c不能单独定植）。定植00502敲除菌株的小鼠粪便中胰蛋白酶活性高于对照，00509敲除菌则部分影响了对胰蛋白酶的降解。与其他34种菌一起定植会影响敲除P.c菌的水平，但对胰蛋白酶活性也起到一定作用。

当WT菌和00502敲除菌同时定植时，WT具有生长优势，这些数据表明，00502在促进体内胰蛋白酶降解方面具有重要作用，胰蛋白酶降解能力使该细菌在竞争条件下具有定殖优势。WT菌株定植小鼠中IgA重链高于敲除菌定植小鼠，而轻链和Reg3β抗菌肽差异不大。

将2-mix+WT P.c菌的小鼠粪便与GF小鼠粪便稀释，过滤，独自孵育或重组胰蛋白酶孵育，表明重链是胰蛋白酶敏感的。而P.c菌定植会保护重链，不被胰蛋白酶水解。作者认为P.c菌介导的胰蛋白酶降解以及对IgA的保护可能会增强口服疫苗对抗肠道病原体。作者对GF小鼠+2-mix+pa菌进行菌群移植，然后口服过氧乙酸灭活的鼠柠檬酸杆菌，再接种活的鼠柠檬酸杆菌。与敲除株定植相比，野生株体重减少更少，鼠柠檬酸杆菌侵入组织更少，IgA水平更高。而且WT pa菌定植小鼠的盲肠悬浊液在体外与C.r菌可以形成凝集。这些数据表明，P.c菌的定植，保护IgA，可以使得对曾遇到的病原体产生更有效的反应。

胰蛋白酶样蛋白TMPRSS2，跨膜蛋白酶丝氨酸2，参与冠状病毒刺突蛋白的蛋白水解激活。其主要表达在肺上皮细胞和肠上皮细胞，可以通过自切割释放其蛋白结构域。

P.c菌定植也能降低TMPRSS2水平。为了测试P.c菌是否能通过降解胰蛋白酶和TMPRSS2起到抑制新冠病毒肠道感染的可能，作者使用了小鼠肝炎病毒MHV-2，跟SARS-Cov2病毒类似。作者先取了小鼠类器官，检测到类器官中有CEACAM1、MHV-2受体4和TMPRSS2的表达。结肠类器官可以被MHV-2感染，并且胰蛋白酶会进一步加重此感染。进一步检测胰蛋白酶水平对体内MHV-2感染的影响，作者通过灌胃感染，发现野生型P.c菌降低粪便、肝、脑MHV-2拷贝数，增加寿命，改善MHV-2诱导的肝脏坏死。