【动物专题】益生菌可预防早期断奶仔猪腹泻

文献概况

题目： Microbiota-DerivedBacteriocin Targets the Host to Confer Diarrhea Resistance in  arly-Weaned Piglets.

作者：Jun hu,Libao Ma,Yangfan Nie等

杂志： Cell Host &Microbe

影响因子：17.872

发表日期：2018.12.12

1 研究背景

早期断奶策略缩短了猪的屠宰周期，提高了母猪的繁殖能力，广泛的应用于畜牧业。但是早断奶应激诱导的腹泻会增加仔猪的死亡率，降低猪的生长性能。

先前主要是把抗生素作为预防早断奶仔猪腹泻的主要手段。然而，抗生素的使用引发的耐药病原体的传播以及食物中抗生素的残留，造成了严重的问题。因此，抗生素的使用逐渐被禁止。

自瑞典1986年禁止在畜牧业生产中使用抗生素以来，早期断奶仔猪应激诱导的腹泻发生率增加了50%，喂养的投入增加了8%~15%。因此，寻找抗生素的替代品对畜牧业和食品安全都极为重要。

越来越多的研究表明，微生物群的靶向重组有治疗胃肠道疾病的潜能。

粪菌移植（FMT）是一种将健康供体的粪菌移植到患者体内的方法。但是，FMT的作用机制以及肠道微生物的作用还不清楚。因此，利用益生菌对肠道菌群进行精确地调控已经成为治疗胃肠道疾病的一种策略。

CM (Congjiang miniature)仔猪比LY(Landrace x Yorkshire)仔猪有更强的抗腹泻性。

相比于十二指肠和回肠，空肠是早期断奶仔猪腹泻引起的肠道炎症以及形态学损伤发生的主要部位。

大量证据表明控制肠上皮液体的吸收和分泌与腹泻密切相关，益生菌可以调控这一过程。有肠道微生物分泌的细胞外蛋白已被证实可以调节肠上皮和微生物的相互作用。

环肽乳酸菌素A（GA）：是由L. gaaAsseri LA39 分泌的，结构稳定，先前有研究表明可以抗多种致病菌。

有研究表明第二信使，如：Ca2+和环核苷酸（如：cAMP和cGMP）可以减少肠内液体的吸收，增强液体的分泌，从而促进腹泻。

2 研究结果：

断奶前口服粪菌微生物，LY仔猪的腹泻发生率以及腹泻发生指数可显著降低，表明粪菌移植(FMT)可预防仔猪早断奶应激诱导的腹泻。

粪菌移植后，受体LY仔猪中5种菌（L. gaaAsseri LA39，L. frumenti,B. pullicaecorum,E. hsllii,B. hansenii）的相对丰度显著增加。其中，加氏乳杆菌（LA39）和谷物乳杆菌（L. frumenti）有抗腹泻效果，有望成为抗生素的替代品。

加氏乳杆菌（LA39）和谷物乳杆菌（L. frumenti）的抗腹泻效果依赖于其产生的乳酸菌素（gaaAssericin A，GAAA），GAAA与肠上皮细胞表面受体角蛋白19（KRT19）结合，经过雷帕霉素靶蛋白(mTOR)增加磷酸二酯酶（PDE）的活性，降低第二信使环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)的水平，从而增强液体的吸收，减少液体的分泌，起到抗腹泻的作用。

在受体LY仔猪中，低剂量(2ml,108CFU/ml)的粪菌比高剂量的(2ml,109CFU/ml)的粪菌的抗腹泻效果更好。表明选择FMT或益生菌作为微生物的靶向治疗策略时，应当考虑最佳的微生物剂量。

2.1  FMT预防了早断奶仔猪应激诱导的腹泻，改变肠道微生物的组成

• 试剂：

• Group1(LY):未使用任何无菌生理盐水或粪便悬浮液

• Group2(LY(saline)):使用无菌生理盐水2ml

• Group3(LY(Higedose)):高浓度粪便悬浮液2ml,109CFU/ml，

• Group4(LY(Lowdose)):低浓度粪便悬浮液2ml,108CFU/ml

• Group5(LY(oxytetracycline)):氧四环素2ml，断奶当天（21天）

• 对象：150只LY仔猪，分为5组，每组30只。每组的30只再分为3个小组

• FMT实验：用上述不同的方式喂养未断奶的LY仔猪，前四组分别是每隔一天口服对应的试剂，第五组是断奶当天喂四环素。每小组中选出一只猪，分别收集者这15只猪断奶后第3,5,6,8,11天的粪便，做16s rDNA和ITS高通量测序。计算断奶后LY仔猪的腹泻发生率以及统计腹泻指数

• 发现：(1)断奶前口服低剂量的粪菌，显著降低了LY仔猪早断奶应激诱导的腹泻的发生率和腹泻指数; (2) FMT使得肠道微生物多样性尤其是细菌的α多样性和β多样性，以及肠道微生物群落的功能，肠道微生物的组成都由LY(saline)向CM仔猪转变; (3)相较于LY(saline)， LY(Low dose)仔猪在断奶后的所有的采样时间点都发现了5种细菌相对丰度的显著增加。确定这5种细菌与抗早断奶应激诱导的腹泻有相关作用。

LY仔猪断奶后1-11天的平均腹泻发生率（左图）和腹泻指标（右图）

基于Unifrac距离矩阵，做PCoA分析肠道微生物的β多样性：细菌群落(有图)，真菌群落(左图)

肠道微生物的α多样性：细菌群落(有图)，真菌群落(左图)

基于PICRUSt对LY仔猪肠道微生物群落的kegg通路注释，用PCA分析

利用matastats对不同分类水平的样本进行显著性差异分析，上图分别是： LY（saline）、LY(Low dose)和CM在门、纲、目、科、属、种不同水平上的分类注释

LY仔猪断奶后，5个不同的时间点取样，比较LY(saline)和LY(Low dose)仔猪的肠道微生物的差异：细菌（左图），真菌（右图）

2.2 断奶前口服5种细菌混合物或L. gaaAsseri LA39、L. frumenti菌株的悬浮液，显著降低断奶LY仔猪腹泻的发生

• 试剂：

• Group1:Ctrl(即没有载体（PBS）也没有细菌悬浮液)

• Group2: PBS (载体，硫酸多黏菌素B),2ml

• Group3:Mix(5种细菌混合培养的悬浮液),2ml,108CFU/ml

• Group4: LG（L.gaaAsseri LA39，加氏乳酸杆菌）,2ml,108 CFU/ml

• Group5: LF（L.frumenti,谷物乳酸杆菌）,2ml,108 CFU/ml

• Group6: BP（Butyricicoccus pullicaecorum,丁酸盐/酯产生菌株）,2ml,108 CFU/ml

• Group7: EH（Eubacterium hallii,霍氏真杆菌）,2ml,108 CFU/ml

• Group8: BH（Blautia hansenii）,2ml,108 CFU/ml

•  对象： 400只LY（未断奶）仔猪，分为8组，每组50只，没组的50只再分为5组，每组10只

• 验证实验：用8种不同方法喂养LY仔猪（6~20天，每天一次），观察断奶应激诱导的腹泻的发生率

• 发现：(1)在断奶前口服抗腹泻相关粪菌，可预防早断奶应激诱导的腹泻; (2)在FMT实验中，LY(Low dose)和CM仔猪对的编码环肽乳酸菌素A(gaaA)基因的相对丰度显著高于其他组；(3)在验证实验中，LG、LF和Mix组的gaaA基因的相对丰度显著地高于对照组。显示：在早断奶仔猪中细菌分泌物GA可能有抗腹泻的作用.

早期断奶后1-11天LY仔猪的平均腹泻发生率(左图)和腹泻指数(右图)

用qPCR检测FMT试验(左图)和验证实验(右图)中编码环肽乳酸菌素A的基因的相对丰度

2.3 在LY早断奶仔猪中的LA39和LF的抗腹泻作用依赖于GA

• 试剂：

• Group1:Ctrl, 即没有载体（PBS）也没有细菌悬浮液

• Group2:PBS, 2ml

• Group3:WT(野生型LA39),2ml,108 CFU/ml

• Group4:rgaaAaA(突变型LA39),2ml,108 CFU/ml

• Group5:gaaAaA complementation(rgaaAaA添加了gaaAaA),2ml,108 CFU/ml

• Group6:E. coli(E. coli BL21,EB3) 2ml,108CFU/ml

• Group7: E. coli+gaaAaA(重组体DE3表达gaaAaA),2ml,108CFU/ml

• 对象：350只LY（未断奶）仔猪，分为7组，每组50只，每组的50只再分为5组，每组10只。

• 实验：分别用7种不同方法喂养LY仔猪（6~20天，每天一次），21天断奶，空肠的肠上皮细胞被分离。

• 发现： 敲除gaaA基因，会显著地增加早断奶腹泻的发生率和指数，同时还会显著的降低gaaA基因的表达量，但是不会显著改变LA39菌的含量。证明：GA对于抗腹泻作用是必要的。LA39的抗腹泻作用依赖于GA。

比较PBS、WT和rgaaA组的早期断奶后1-11天的腹泻发生率(左图)和腹泻指数（右图），发现：rgaaA组的腹泻发生率和指数显著高于WT组

通过qPCR定量gaaA基因的相对丰度（左图），发现：rgaaA组的仔猪的相对基因丰度显著低于WT组；通过16s rDNA测序技术，检测到LA39菌的相对丰度（右图），发现：rgaaA组的LA39的相对丰度和WT组没有显著差异

2.4  GA结合到肠上皮细胞的细胞膜，促进肠内液体的吸收和降低肠内液体的分泌

• 材料：上述实验中仔猪断奶后的空肠上皮细胞，培养的猪的空肠上皮细胞(IPEC-J2)

• 实验：免疫荧光染色

• 结论：(1)体内、外免疫荧光染色都说明了：GA可以结合到肠上皮细胞; (2)GA可以通过增加促进肠液吸收的蛋白表达，以及抑制肠液分泌蛋白的表达，达到抗腹泻的作用;(3)GA可以显著降低cAMP和cGMP的含量,起到抗腹泻的效果

体内免疫荧光染色（上图），WGS染空肠上皮细胞膜、GA由anti-GA抗体染色、细胞核被DAPI染色。结果显示，GA可以结合到肠上皮细胞。

体外免疫荧光染色（上图），WGS染IPEC-J2细胞膜、His-GA由anti-6xHis抗体染色、细胞核被DAPI染色。结果显示，GA可以结合到肠上皮细胞

在上图中，在IPEC-J2细胞中,随着His-GA浓度的增加以及时间的增加，His-GA会显著地增加和肠液吸收相关的蛋白的表达（NHE3,SLC5A1，DRA，PAT1），显著减少和肠液分泌相关的蛋白（NKCC1，CFTR,CaCC1）的表达。

上图环核苷酸（CN）在用His-GA处理时，加入后2h和4h时环核苷酸（cAMP和cGMP）的水平; 表示在IPEC-J2细胞中，用His-GA处理会显著地降低cAMP和cGMP的水平

2.5  GA通过KRT19结合到肠上皮细胞的细胞膜，起到促进肠液吸收和减少肠内液体的分泌的作用

• 材料：IPEC-J2细胞

• 实验：免疫共沉淀、免疫荧光检测

• 结论： GA与肠上皮细胞上的角蛋白KRT19结合

免疫共沉淀方法（上图），右图说明与KRT18/KRT19可能与GA或His-GA发生相互作用，右图验证了KRT19与GA或His-GA发生相互作用

免疫荧光检测（上图），说明了在IPEC-J2细胞的细胞膜上GA或Jis-GA可以和KRT19结合

2.6  mTOR激活PDEs，激活的PDEs会减少细胞的环核苷酸，环核苷酸的减少使得GA增加肠内液体的吸收和减少肠内液体的分泌

• 材料：IPEC-J2细胞，（PDE激活抑制剂），IBMX

• 结论：(1)PDEs的激活对于GA减少环核苷酸水平、增加肠内液体的吸收以及减少肠内液体的分泌等性能至关重要; (2) GA可以显著地增加mTOR的活性; (3)GA和肠上皮细胞膜上的KRT19蛋白结合，通过激活mTOR激活PDE,进而增加肠内液体的吸收，减少肠内液体的分泌

上图显示在IPEC-J2细胞膜上，通过His-GA的增加会显著的增加PDEs，但是不会对环化酶的水平有显著的改变

上图表明：加入IBMX，可以抑制GA的抗腹泻的作用

上图表明：随着GA浓度的增加，mTOR以及它的两个的两个下游蛋白（p10S6K1和4E-BP1）显著上调

上图显示：RAPA的加入会抑制GA对换苷酸的减少，抑制对PDE的激活，以及抑制促肠内液体吸收的蛋白的增加，增加促进肠内液体分泌相关的蛋白。

文献链接：

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(18)30563-8

联系我们请在公众号回复“咨询”

欢迎关注“菌群问疾”

您可能感兴趣：

糖尿病个体化治疗 | 这次科学家们把目光投向了肠道共生菌群

BGISEQ自主平台meta测序教师节感恩回馈

过去十余年，微生物科研经历了怎样的发展？

三代测序产量越高越好？您可能掉坑里了！

开学啦，和Dr. Tom一起玩转个性化分析！

作者：宋艳妮
编辑：白   洁